Generazione di Gαi bussare

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 112 (2023) Citare questo articolo

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I recettori accoppiati alle proteine ​​G (GPCR) sono proteine ​​fondamentali della membrana cellulare che rilevano le molecole extracellulari e attivano le risposte cellulari. La famiglia della subunità i (Gαi) della proteina G rappresenta il partner di accoppiamento GPCR più comune ed è composta da otto subunità con proprietà di segnalazione distinte. Tuttavia, l’analisi del modello di accoppiamento è stata impegnativa a causa dell’espressione endogena delle subunità Gαi praticamente in tutte le linee cellulari. Qui, generiamo una linea cellulare HEK293 priva di tutte le subunità Gαi, che consente la misurazione dell'accoppiamento GPCR-Gαi dopo la riespressione transitoria di una specifica subunità Gαi. Profiliamo la selettività dell'accoppiamento Gαi attraverso 11 GPCR misurando l'attività inibitoria indotta dal ligando per l'accumulo di cAMP. I profili di accoppiamento vengono quindi classificati in tre cluster, che rappresentano quelli preferenzialmente accoppiati a Gαz, quelli a Gαo e quelli con selettività non apparente. Questi risultati indicano che i singoli GPCR accoppiati a Gαi ottimizzano la segnalazione di Gαi esercitando la preferenza di accoppiamento a livello della subunità Gαi.

I recettori accoppiati alle proteine ​​G (GPCR), i trasduttori chiave che collegano gli stimoli extracellulari ai segnali intracellulari a valle, sono gli obiettivi più comuni per lo sviluppo di farmaci1. Dopo il legame con il ligando GPCR, le proteine ​​eteromeriche leganti i nucleotidi della guanina (proteine ​​G), costituite da subunità α, β e γ, inducono l'attivazione delle loro proteine ​​effettrici. Tra le tre subunità, la subunità α determina principalmente le proprietà chiave delle singole proteine ​​G eterotrimeriche. Il genoma umano codifica 16 subunità α, che sono raggruppate in quattro sottofamiglie in base alla loro omologia di sequenza e somiglianza funzionale, vale a dire Gαs, Gαi, Gαq e Gα122. La sottofamiglia Gαi è il partner di accoppiamento più comune nei GPCR della famiglia A3,4. Inoltre, circa il 45% dei GPCR presi di mira dai farmaci approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti si accoppiano alla sottofamiglia Gαi5, evidenziando l’importanza dei GPCR accoppiati a Gαi come bersagli farmacologici.

Studi precedenti hanno dimostrato che le subunità Gαi hanno funzioni sia sovrapposte che distinte. La sottofamiglia Gαi è composta da otto subunità α: Gαi1, Gαi2, Gαi3, Gαt1, Gαt2, Gαt3, Gαo e Gαz. L'attivazione dell'eterotrimero Gi induce vari processi di segnalazione cellulare come l'inibizione dell'adenilato ciclasi e dei canali del calcio e l'attivazione dei canali del potassio6. Nonostante l'elevata omologia di sequenze all'interno della sottofamiglia Gαi, sono state segnalate diverse funzioni specifiche della subunità. Ad esempio, la transducina (Gαt1 e Gαt2) e la gustducina (Gαt3) sono coinvolte rispettivamente nella percezione visiva e gustativa, entrambe attivando la fosfodiesterasi cGMP7,8. Inoltre, utilizzando esperimenti di knockdown della subunità Gαi nelle cellule GH4C1, è stato scoperto che Gαo e Gαi2 mediano rispettivamente l'inibizione dell'ingresso di calcio e l'accumulo di cAMP9. Anche le subunità Gαi si comportano biochimicamente diverse l'una dall'altra. Va notato, tuttavia, che queste proprietà biochimiche potrebbero essere modificate nelle cellule viventi come osservato in Gq, che mostra una dissociazione nucleotidica più lenta in condizioni purificate rispetto alla condizione di membrana lipidica. Ad esempio, il tasso di dissociazione spontanea del PIL da Gαo è un ordine di grandezza più veloce di quello di Gαi1-310 e l'attività intrinseca GTPasi di Gαz è 200 volte più lenta di quella delle altre subunità Gαi11. Queste differenze tra i membri della famiglia Gαi consentono una diversa trasduzione del segnale GPCR accoppiato a Gαi.

Sebbene le proprietà di segnalazione delle subunità Gαi siano state ben caratterizzate, la selettività di accoppiamento della subunità Gαi dei GPCR è stata studiata solo per un numero limitato di recettori a causa di difficoltà sperimentali. L'accoppiamento individuale GPCR-Gαi non può essere valutato semplicemente esprimendo una subunità Gαi di interesse perché praticamente tutte le cellule dei mammiferi esprimono a livello endogeno più subunità Gαi12. Per eliminare l'accoppiamento endogeno GPCR-Gαi, studi precedenti hanno utilizzato la tossina della pertosse (PTX), che ADP-ribosila il residuo di cisteina nella coda C-terminale delle subunità Gαi13. Esprimendo un mutante Gαi resistente al PTX con una sostituzione nel residuo di cisteina, il trattamento PTX consente la misurazione dell'accoppiamento selettivo della subunità Gαi mutante14,15,16. Tuttavia, l'alterazione del residuo di cisteina può influenzare le capacità di accoppiamento delle proteine ​​G delle subunità α17,18. Inoltre, PTX non inibisce Gαz poiché contiene isoleucina nel sito di targeting PTX19. Recentemente, sono state utilizzate tecniche basate sul trasferimento di energia mediante risonanza di fluorescenza o bioluminescenza per valutare l'accoppiamento di singole subunità Gα ingegnerizzate20,21. Tuttavia, questi metodi richiedono l'inserimento della luciferasi o di una proteina fluorescente nella subunità α e tale modifica influisce sulle sue proprietà biochimiche e sulla conseguente efficienza di accoppiamento22.